Mi a peptidszintézis

 

A peptidszintézis a fehérje- és peptidkémia aktív területe, amely jellemzően aminosavak szekvenciális hozzáadását foglalja magában, meghatározott sorrendben a peptidlánc kémiai módszerekkel történő kialakítása érdekében. A fő szintézis módszerek a folyadékfázisú és a szilárd fázisú szintézis. Az LPPS-hez képest az SPPS előnye, hogy gyorsabb, egyszerűbb, kevesebb mellékreakcióval és magasabb hozamokkal rendelkezik.

 

Szabványos SPPS-módszer, beleértve a Boc (benzil) és Fmoc (tBu) stratégiákat.

 

 

Boc (benzil) stratégia

Ebben a szintézis megközelítésben szilárd hordozóként klórmetilezett, hidroximetilezett polisztirol és p-metoxibenzil (PMA) gyantákat használnak. Az -aminocsoportot terc-butoxikarbonil-csoporttal (Boc), míg az aminosavak oldalláncait benzil-származékokkal védjük. A Boc-csoportot tiszta TFA-val vagy TFA-val CH2Cl2-ben távolítják el, és a szintézis végén az oldallánc-védőcsoportokat és a peptid-gyanta kötéseket erős savval, például vízmentes hidrogén-fluoridsavval (HF) vagy TFMSA-val távolítják el.

 

Fmoc (tBu ) stratégia

Ebben a szintézis megközelítésben szilárd hordozóként Wang-gyantát, 2-klór-tritil-klorid-gyantát, Rink-amid-AM-gyantát, Rink-amid-MBHA-gyantát használnak. Az -amino-csoportot 9-fluorenil-metoxi-karbonil-csoporttal (Fmoc) védjük. ), míg az aminosavak oldallánc-csoportjait savlabilis védőcsoportok védik. Az Fmoc-csoportot 20% piperidinnel DMF-ben távolítják el, és a szintézis végén az oldallánc védőcsoportokat és a peptid-gyanta kötéseket 1% -95% TFA-val távolítják el. Az Fmoc SPPS jelenleg a peptidszintézis előnyben részesített módszere.

 

Az Fmoc szilárd fázisú peptidszintézis alapelvei

 

Válassza a Gyantát

Az Fmoc SPPS-ben legszélesebb körben alkalmazott gyanták, köztük az 4-alkoxibenzil-alkohol (Wang) gyanta, a 2-klór-tritil-klorid gyanta, a Rink amid gyanta, a Rink Amide-MBHA gyanták. Az amidgyantákat a szükséges C-terminális amidálással rendelkező peptidek szintézisére használják. A Wang gyantát és a 2-Cl Trt gyantát gyakran használják a szükséges C-terminális szabad COOH-val rendelkező peptidek szintézisére. De ha a peptid C-terminálisán a Pro és a Gly az első aminosav, a Wang gyantát nem szabad használni a DKP (diketopiperazin) képződésének veszélye miatt, a 2-klórotritil-klorid gyanta használata javasolt.

 

 

Védett aminosavak rögzítése a gyantákhoz

Az első Fmoc aminosav egy oldhatatlan hordozó gyantához kapcsolódik egy savra labilis linkeren keresztül.

 

Az -amino-védőcsoport védőcsoportjának eltávolítása

A peptidil-gyanta N-terminálisán lévő ideiglenes Fmoc-védőcsoportot 20%-os DMF-ben készült piperidin-oldattal történő kezeléssel távolítjuk el. Ez a reakció általában 10-20 percen belül befejeződik.

 

Mosási lépések

Minden kémiai reakció után mosási lépéseket hajtanak végre a felesleges reagensek, melléktermékek és elreagálatlan molekulák eltávolítására a gyantáról. Ez segít megőrizni a növekvő peptidlánc tisztaságát.

 

A védett aminosav aktiválása és kapcsolása

A gyantához kötött védett aminosav aktiválódik, hogy fokozza annak reakcióképességét a szekvencia következő aminosavához való kapcsolódáshoz. A gyakori aktiválószerek közé tartozik a HOAt, HOBt, PyBOP, PyAOP, HBTU és HATU. A kapcsolás magában foglalja egy peptidkötés kialakítását az aktivált aminosav és a növekvő peptidlánc aminocsoportja között. A Kaiser-tesztet általában a kapcsolási reakciók teljességének ellenőrzésére használják.

 

Mosási lépések

A korábbi mosási lépésekhez hasonlóan ez is biztosítja a felesleges reagensek és melléktermékek eltávolítását a kapcsolási reakció után.

 

A gyantáról való lehasítás és az oldallánc védőcsoportok védőcsoportjainak eltávolítása

Amint a kívánt peptidszekvencia szintetizálódott a gyantán, lehasad a szilárd hordozóról hasítási koktél, például trifluor-ecetsav (TFA) segítségével, amely kötőanyagokat, például tioanizolt és vizet tartalmaz. Ezzel egyidejűleg az oldallánc védőcsoportjait eltávolítják az aminosavmaradékokról, így kiderül a védőcsoport teljes eltávolítása, amely készen áll a tisztításra és elemzésre.